枇杷為薔薇科常綠植物，是起源于我國的名果異樹，北宋藥學(xué)家蘇頌在《本草圖經(jīng)》中用“木高丈余，肥枝長葉……熟時色如黃杏，…，核大如茅栗，黃褐色。四月采葉，暴干用”來描述枇杷作為藥、果兩用植物的特性。根據(jù)《史記·司馬相如傳》記載，早在2000多年前的西漢時代，我們的先輩就開始生產(chǎn)甜美多汁的枇杷果實。此外，枇杷葉片長久以來作為傳統(tǒng)藥物被中國及周邊國家民眾用于治療咳嗽、慢性支氣管炎、炎癥等多種疾病。藥理研究表明，枇杷中的一些三萜酸等天然小分子，如熊果酸和科羅索酸，具有抗癌和降血糖等多種生物活性，也是其入藥的重要代謝物基礎(chǔ)。然而，枇杷何以富含三萜酸等活性小分子的分子進化機制一直不為公眾所知。

 

　　近日，華南農(nóng)業(yè)大學(xué)林順權(quán)研究組聯(lián)合上海交大劉振華研究組及深圳華大基因、莆田學(xué)院等單位合作在《美國科學(xué)院院報》（PNAS）上發(fā)表題為“Polyploidy underlies co-option and diversification of biosynthetic triterpene pathways in the apple tribe”的研究論文。（地址https://doi.org/10.1073/pnas.2101767118）該論文綜合運用基因組、代謝組、轉(zhuǎn)錄組與合成生物學(xué)等研究手段，系統(tǒng)分析了枇杷中主要三萜酸小分子在蘋果亞科全基因組復(fù)制前后的合成通路、表達(dá)模式以及進化路線。研究表明，蘋果族植物大約在13至27 百萬年前發(fā)生了一次全基因組復(fù)制（WGD）事件。與相近物種相比，枇杷基因組在WGD之后保留下了2套完整的烏蘇烷型三萜酸合成通路基因。同時，這兩套基因在枇杷葉等組織中表現(xiàn)出更緊密的共表達(dá)關(guān)系。經(jīng)歷全基因組復(fù)制、代謝通路的共選擇和代謝基因緊密高表達(dá)后，枇杷葉相比其他薔薇科植物獲得了更強的熊果酸和科羅索酸等主要三萜酸的富集能力。該研究從基因組水平上為枇杷作為藥用植物提供了遺傳學(xué)與基因組學(xué)證據(jù)。

　　枇杷富含三萜酸的分子進化基礎(chǔ)

 

　　該聯(lián)合團隊首先結(jié)合PacBio、Hi-C（華大自主研發(fā)DNBSEQ平臺） 和 Illumina測序組裝了枇杷主栽品種‘解放鐘’染色體水平的高質(zhì)量基因組。同時為方便開展比較基因組學(xué)分析，團隊還率先組裝了蘋果族近緣植物美吐根（Gillenia trifoliata）染色體水平的高質(zhì)量基因組。多物種的單拷貝基因進化分析表明，蘋果族植物（含枇杷、蘋果和梨在內(nèi)）在大約13.5至27.1 百萬年前與美吐根祖先發(fā)生了物種分化。染色體共線性分析發(fā)現(xiàn)，美吐根/桃與枇杷/蘋果的染色體共線性塊存在1:2的關(guān)系，預(yù)示枇杷/蘋果所在分支在演化過程中發(fā)生了全基因組復(fù)制事件（WGD）。

　　比較基因組分析證實蘋果族在13.5至27.1百萬年前發(fā)生了全基因組復(fù)制

 

　　為判斷枇杷與近緣物種葉片三萜酸積累能力的差異，研究團隊系統(tǒng)分析了桃-美吐根-枇杷-蘋果不同發(fā)育階段葉片中的三萜酸組分和總量差異。結(jié)果表明，分析的四個物種均主要積累烏蘇烷型和齊墩果烷型三萜酸，有意思的是枇杷成熟葉片的三萜酸（特別是熊果酸和科羅索酸為主的烏蘇烷型三萜酸）積累總量是桃-美吐根-蘋果的近10倍。更細(xì)致的發(fā)育階段代謝分析表明，枇杷葉在葉片發(fā)育中期即開始大量積累熊果酸，而在葉片老熟階段才開始大量合成科羅索酸。為鑒定在葉片等組織中合成枇杷烏蘇烷型三萜酸的主要催化酶基因，團隊首先以不同類型三萜酸合成第一步關(guān)鍵催化步驟酶基因家族鑒定為切入點，結(jié)合組織轉(zhuǎn)錄組分析，發(fā)現(xiàn)2個高表達(dá)的氧化鯊烯合成酶基因EjOSC1/2（其同源基因編碼蛋白主要合成α香樹精，烏蘇烷型三萜酸的前體）。同時圍繞這兩個OSC基因?qū)D(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進行共表達(dá)分析，挖掘到兩個三萜酸修飾基因，CYP716A和CYP716C。煙草瞬時表達(dá)表明，枇杷中含有至少兩條完整的烏蘇烷型三萜酸合成通路：EjOSC1-EjCYP716A1-EjCYP716C1和EjOSC2-EjCYP716A2-EjCYP716C2。

　　枇杷三萜酸合成基因鑒定與代謝通路推定

 

　　通過對桃、美吐根（WGD事件之前）以及蘋果、枇杷（WGD事件之后）在基因組、代謝組和轉(zhuǎn)錄組等多組學(xué)的綜合研究，研究人員發(fā)現(xiàn)，合成烏蘇烷類型的三萜酸OSC-CYP716A-CYP716C在WGD事件之前就已經(jīng)存在，全基因組復(fù)制后，該通路得以在枇杷中完整復(fù)制和保留。有意思的是，OSC-CYP716A-CYP716C通路基因在枇杷中的共表達(dá)相關(guān)性遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于美土根，表明全基因組復(fù)制后，代謝通路變得更高效。

 

　　綜上，該研究揭示了枇杷葉在漫長人類歷史發(fā)展過程中被選作藥材的一種可能的分子進化機制。同時，也為利用合成生物學(xué)開發(fā)高價值的天然小分子以及枇杷分子育種提供了基因組基礎(chǔ)，還為薔薇科的比較基因組學(xué)、進化生物學(xué)等研究提供了高質(zhì)量的基因組支撐。

 

　　以上研究工作由林順權(quán)課題組聯(lián)合深圳華大基因、莆田學(xué)院和上海交通大學(xué)等多家單位協(xié)作完成。華南農(nóng)業(yè)大學(xué)蘇文炳博士（現(xiàn)福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹研究所副研究員）、深圳華大基因靜一，林授鍇（莆田學(xué)院）  、岳震（華大）和楊向暉（華農(nóng)）為共同第一作者；華南農(nóng)業(yè)大學(xué)林順權(quán)教授和上海交通大學(xué)劉振華副教授為共同通訊作者。華南農(nóng)業(yè)大學(xué)夏瑞研究組以及英國諾丁漢大學(xué)LeviYant等參與了本研究。研究的開展得到了農(nóng)業(yè)農(nóng)村部公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專項（201003073）、福建省高校服務(wù)海西建設(shè)重點項目（2008HX02）、國家自然科學(xué)基金（31901973）、上海市浦江人才計劃、國家重點研發(fā)（2019YFD1000200）等項目的共同資助。、