近年來，伴隨CRISPR/Cas9基因精確編輯體系的發(fā)展，克隆技術在豬分子育種上的應用潛力逐漸顯現(xiàn)，一批與優(yōu)勢經(jīng)濟性狀和抗病性狀相關的克隆豬模型被紛紛創(chuàng)制。而由于豬和人類生理結構的相似性，克隆豬模型還可應用于人類器官再造和疾病病理研究，這都反映出豬克隆技術在農業(yè)育種和生物醫(yī)學領域存在巨大的應用前景。非瘟疫情影響下，克隆技術還能應用于地方種、引進種和新培育豬品種的種質資源保存。

 

　　不過自克隆羊“多莉”誕生以來，哺乳動物克隆胚胎早期發(fā)育的高損率（克隆囊胚率僅10-15%，受精囊胚率可達30-80%）和極低的出生效率（克隆動物約1-2%，受精動物可達40-60%）一直是限制克隆技術推廣應用的瓶頸問題。目前的主流觀點認為，受體卵母細胞對供體細胞基因組存在天然的重編程障礙，導致克隆胚胎出現(xiàn)表觀遺傳修飾的異常富集和相應基因的異常表達，而尋找克服重編程障礙的有效方法一直是突破豬克隆技術應用壁壘的研究熱點。

 

　　本研究首次結合近年來開發(fā)的低細胞量轉錄組測序（Smart-seq）技術，從全基因組層面鑒定了豬克隆胚胎在合子基因組激活階段（4細胞期）異常表達的基因和基因組區(qū)域。同時，利用低細胞量的全基因組DNA甲基化測序（PBAT-seq）和染色質免疫共沉淀測序（ULI-NChIP-seq）技術，確定了上述異常表達的基因啟動子和基因組區(qū)域中存在高水平富集的DNA甲基化和組蛋白甲基化H3K9me3、H3K27me3。最重要的是，針對這些重編程障礙，該研究開發(fā)了兩項有效提高豬克隆胚胎發(fā)育能力的新方法：1）聯(lián)合使用顯微注射技術在克隆胚胎中過表達H3K9me3的去甲基化酶KDM4A，并向胚胎培養(yǎng)液中添加H3K27me3編寫酶抑制劑GSK126；2）使用誘導表達與DNA去甲基化相關的胸腺嘧啶糖基化酶TDG的供體細胞株構建克隆胚胎。上述克服途徑均不同程度地調整了豬克隆胚胎基因和基因組區(qū)域的異常表達，并最終使克隆胚胎的囊胚率提高近兩倍。

　　豬克隆胚胎在合子基因組激活階段的重編程障礙和克服途徑

 

　　華中農業(yè)大學動科動醫(yī)學院副研究員劉鑫和王濤博士、生命科學技術學院陳露博士后為論文的共同第一作者，我校苗義良教授和陳振夏教授為論文通訊作者。本研究受到了國家重點研發(fā)計劃和國家自然科學基金的資助。

 

　　【英文摘要】

 

　　Pig cloning by somatic cell nuclear transfer （SCNT） frequently undergoes incomplete epigenetic remodeling during the maternal-to-zygotic transition, which leads to a significant embryonic loss before implantation. Here, we generated the first genome-wide landscapes of histone methylation in pig SCNT embryos. Excessive H3K9me3 and H3K27me3, but not H3K4me3, were observed in the genomic regions with unfaithful embryonic genome activation and donor-cell-specific gene silencing. A combination of H3K9 demethylase KDM4A and GSK126, an inhibitor of H3K27me3 writer, were able to remove these epigenetic barriers and restore the global transcriptome in SCNT embryos. More importantly, thymine DNA glycosylase （TDG） was defined as a pig-specific epigenetic regulator for nuclear reprogramming, which was not reactivated by H3K9me3 and H3K27me3 removal. Both combined treatment and transient TDG overexpression promoted DNA demethylation and enhanced the blastocyst-forming rates of SCNT embryos, thus offering valuable methods to increase the cloning efficiency of genome-edited pigs for agricultural and biomedical purposes.

 

　　論文鏈接：https://www.cell.com/stem-cell-reports/fulltext/S2213-6711（21）00489-6