豇豆（Vigna unguiculataL.Walp.）作為一種耐高溫、抗干旱的豆科植物，廣泛種植于全球熱帶和亞熱帶地區(qū)，如亞洲、非洲和美洲等。它不僅具有高營養(yǎng)價值，提供豐富的蛋白質(zhì)、維生素和微量元素，還具有顯著的藥用價值。豇豆不僅是營養(yǎng)的來源，也是促進(jìn)可持續(xù)農(nóng)業(yè)和改善公共健康的重要作物。但是豇豆的生產(chǎn)常常受到多種生物脅迫的影響，其中豇豆花葉病毒（Cowpea mosaic virus, CPMV）是最具破壞性的病毒之一。CPMV能夠引起植物的黃化病斑，嚴(yán)重影響作物產(chǎn)量和質(zhì)量。因此，了解植物如何識別和抵御這種病毒，對于提高作物的抗病性至關(guān)重要。然而，目前關(guān)于豇豆花葉病毒與植物的互作研究的進(jìn)展非常有限。

 

　　豇豆花葉病毒CPMV編碼的半胱氨酸蛋白酶24KPro不僅介導(dǎo)病毒寡聚蛋白的剪切以促進(jìn)病毒的成熟組裝，同時還作為病毒效應(yīng)子觸發(fā)植物的免疫反應(yīng)。因此，該研究以24KPro為切入點(diǎn)，利用酵母雙雜交篩選豇豆cDNA文庫以及免疫沉淀-質(zhì)譜法（IP-MS）篩選到了12個候選互作蛋白，后續(xù)通過多種生化手段發(fā)現(xiàn)豇豆LTP1能夠與24KPro互作并且兩者之間的相互作用依賴于24KPro的半胱氨酸蛋白酶活性。進(jìn)一步通過基因功能驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)CPMV侵染豇豆葉片后LTP1被顯著誘導(dǎo)表達(dá)，在煙草和豇豆中過表達(dá)LTP1能夠顯著抑制葉片中CPMV的積累，而沉默LTP1表達(dá)則會導(dǎo)致病毒在豇豆葉片中的積累量顯著增加。這些結(jié)果說明LTP1在豇豆的CPMV抗性調(diào)節(jié)中發(fā)揮了關(guān)鍵作用。

 

　　對LTP1的功能機(jī)制進(jìn)行解析，發(fā)現(xiàn)在健康的植物細(xì)胞中LTP1通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體介導(dǎo)的分泌途徑定位于質(zhì)外體，在此過程中LTP1的信號肽被切割。CPMV感染植物細(xì)胞后，豇豆LTP1的蛋白定位改變，主要富集在細(xì)胞質(zhì)和葉綠體。在胞質(zhì)中，LTP1與CPMV 24KPro存在共定位，進(jìn)一步的蛋白酶活性實(shí)驗(yàn)表明LTP1能夠直接與24KPro相互作用并抑制其蛋白酶活性，從而阻礙CPMV在植物中的繁殖，促進(jìn)植物的CPMV抗性。

 

　　此外，研究還發(fā)現(xiàn)過表達(dá)豇豆LTP1的轉(zhuǎn)基因煙草對于大豆花葉病毒SMV的抗性明顯增強(qiáng)，SMV編碼與24KPro類似的3CL-Pro NIa，豇豆LTP1同樣可以顯著抑制NIa的半胱氨酸蛋白酶活性。因此，豇豆LTP1可能作為一種半胱氨酸蛋白酶的光譜抑制劑，在植物病毒抗性育種方面有潛在用途。

 

　　華中農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院已畢業(yè)博士季捷（現(xiàn)為生科院博士后）為論文的第一作者，樊秋玲副教授為論文的通訊作者。華中農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院端木德強(qiáng)教授、華中農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝林學(xué)學(xué)院王鵬蔚教授、加州大學(xué)戴維斯分校George Bruening教授等也參與了本項(xiàng)研究。該研究得到國家自然科學(xué)基金和華中農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院龍云計劃的支持。

 

　　【英文摘要】

 

　　Many virus genomes encode proteases that facilitate infection. The molecular mechanism of plant recognition of viral proteases is largely unexplored. Using the system ofVigna unguiculataand cowpea mosaic virus （CPMV）， we identified a cowpea lipid transfer protein （LTP1） which interacts with CPMV-encoded 24KPro, a cysteine protease, but not with the enzymatically inactive mutant 24KPro（C166A）。 Biochemical assays showed that LTP1 inhibited 24KPro proteolytic cleavage of the coat protein precursor LCP-sCP. Transient overexpression of LTP1 in cowpea reduced CPMV infection, whereas RNAi-mediatedLTP1silencing increased CPMV accumulation in cowpea. LTP1 is mainly localized in the apoplast of uninfected plant cells, and after CPMV infection, most of the LTP1 is relocated to intracellular compartments, including chloroplast. Moreover, in stableLTP1-transgenicN. benthamianaplants,LTP1 repressed SMV NIa protease activity and accumulation of soybean mosaic virus （SMV） was significantly reduced. We propose that cowpea LTP1 suppresses CPMV and SMV accumulation by directly inhibiting viral cysteine protease activity.

 

　　論文鏈接： https://www.pnas.org/doi/10.1073/pnas.2403424121