大豆是我國重要糧油飼兼用作物，提升產(chǎn)量和品質是我國大豆產(chǎn)業(yè)面臨的重大挑戰(zhàn)。大豆是高蛋白作物，對氮素的需求高。在長期進化過程中，大豆演化出了共生固氮這個重要的優(yōu)異性狀，即在土壤氮素不足的情況下，與根瘤菌互作共生形成根瘤，將空氣中的氮氣還原為氨，為植物提供充足的氮素。據(jù)研究報道，共生固氮可為植物總生物量提供近70 %的氮素，為其籽粒提供超過80%的氮素。因此，提高共生固氮效率是提升大豆產(chǎn)量和品質的重要途徑。適宜的根瘤數(shù)量是決定共生固氮效率的首要因子。在過去的近三十年中，豆科植物結瘤的分子遺傳調控機制研究取得了重要進展，但主要集中在大量必需養(yǎng)分（如氮）變化下結瘤的內在調控機制方面。全球氣候變暖加劇了耕地鹽堿化，導致土壤微量必需養(yǎng)分（如鐵等）難以被吸收，導致作物共生固氮能力下降，產(chǎn)量品質降低。因此，明確微量必需養(yǎng)分在大豆等豆科作物結瘤中的作用，解析其分子調控機制，對進一步提高大豆等作物的共生固氮效率及產(chǎn)量品質具有重要意義。

 

　　鐵是植物和微生物生長發(fā)育所必需微量養(yǎng)分，參與呼吸、光合等多個生物過程。鐵也是固氮酶和豆血紅蛋白重要組成成分，是豆科植物成熟根瘤的固氮活力一個決定因子。然而，鐵在大豆等根瘤形成中的作用以及大豆感知環(huán)境鐵并將鐵信號整合到結瘤信號中的分子機制尚不清楚。

 

　　為了研究鐵對大豆結瘤的影響，研究團隊首先建立了一個水培體系，系統(tǒng)評價了不同鐵濃度對根瘤菌侵染（侵染線和根瘤原基）和根瘤數(shù)量的影響。結果發(fā)現(xiàn)，即使在充足光照和氮匱缺條件下，沒有鐵大豆-根瘤菌共生結瘤過程完全被抑制，說明鐵是大豆結瘤一個重要驅動力。此外，明確了大豆共生結瘤的最適宜鐵濃度大約是40  µM，鐵低于該劑量造成養(yǎng)分不足，而高于該水平造成氧化脅迫均抑制早期侵染事件和根瘤的形成。進一步分子和遺傳學研究發(fā)現(xiàn)，鐵是通過影響大豆共生結瘤上游轉錄因子GmNSP1a蛋白的穩(wěn)定和轉錄活性，進而調控核心基因GmNINs的表達水平來發(fā)揮作用。

 

　　由于GmNSP1a不具備識別和結合鐵的結構域，研究團隊推測GmNSP1a蛋白可能接受到一個鐵響應蛋白傳遞來的信號。通過酵母雙雜交篩選，他們篩選到一個與鐵相關的GmNSP1a互作蛋白。該蛋白N端含有結合鐵的Haemerythrin（HHE）結構域、C端含有RING zinc-finger 結構域的蛋白，是擬南芥鐵受體BTS的同源蛋白，因此命名為GmBTSa。 通過基因家族分析發(fā)現(xiàn)大豆4個BTS同源蛋白中，GmBTSa和GmBTSb同源性最高，主要在根瘤中高表達。蛋白互作實驗證明GmNSP1a能夠與GmBTSa和GmBTSb蛋白C端的RING zinc-finger結構域相互作用?；蚬δ苎芯堪l(fā)現(xiàn)，GmBTSa和GmBTSb的轉錄和翻譯均受到根瘤菌的誘導，并協(xié)同正向調控大豆結瘤。隨后發(fā)現(xiàn)，GmBTSa蛋白具有結合鐵離子能力并在結合鐵后變得更加穩(wěn)定，正向調控低鐵信號和鐵吸收，Gmbtsa btsb雙突變體幾乎完全喪失了低鐵抑制結瘤的效應，證明GmBTSa/GmBTSb作為鐵受體介導大豆在低鐵下的結瘤過程。進一步生化實驗證明，GmBTSa/GmBTSb與GmNSP1a結合并促進其蛋白穩(wěn)定性和對GmNIN基因轉錄活性。由此可見，鐵受體GmBTSa/GmBTSb在感受鐵信號后，進一步調控GmNSP1a蛋白的轉錄活性影響大豆結瘤對環(huán)境鐵的響應。

 

　　進而，研究團隊證明了GmBTSa是一個E3泛素連接酶，但是與擬南芥同源蛋白BTS多泛素化修飾并降解底物調控植物對低鐵響應不同，大豆的GmBTSa是通過特異地單泛素化修飾GmNSP1a促進其蛋白穩(wěn)定性和轉錄活性來促進結瘤。研究團隊通過IP-MS技術鑒定了GmNSP1a上被GmBTSa單泛素化的賴氨酸，并發(fā)現(xiàn)將這些賴氨酸突變后的GmNSP1a（GmNSP1a5KR）不再被GmBTSa單泛素化修飾，蛋白的穩(wěn)定性和轉錄活性也顯著下降，更重要的是突變蛋白GmNSP1a5KR不能恢復Gmnsp1a突變體的結瘤表型，證明單泛素化修飾對GmNSP1a促進結瘤的功能是不可或缺的。NSP1是豆科植物結瘤信號中的一個共有的重要信號組分。最后，研究團隊通過生物信息學分析和遺傳與生化實驗證明，BTS通過單泛素化修飾NSP1并促進結瘤的分子機制在豆科植物中是保守的。

 

　　基于以上實驗，研究團隊提出了如下的模型：在鐵充足的條件下，BTS在轉錄和翻譯中，水都被根瘤菌誘導，在結合并感受鐵后蛋白穩(wěn)定性增強，通過單泛素化修飾NSP1促進其蛋白的穩(wěn)定和轉錄活性，激活共生核心基因NIN的表達，進而促進根瘤菌侵染和根瘤的形成；而在缺鐵條件下，BTS蛋白變得不穩(wěn)定造成對NSP1蛋白的單泛素化修飾作用減弱，導致NSP1蛋白的穩(wěn)定性和轉錄活性下降，從而抑制共生信號以及結瘤過程。

 

　　綜上所述，該研究明確了鐵元素在大豆共生結瘤過程中的重要作用，并解析了鐵受體BTS-共生信號關鍵轉錄因子NSP1構成的分子調控模塊通過監(jiān)測外部鐵水平調控豆科植物結瘤的分子機制。這些研究結果揭示了微量必需營養(yǎng)元素鐵驅動的豆科植物結瘤分子遺傳基礎，不僅為提高大豆等豆科作物在鹽堿環(huán)境下的結瘤與共生固氮效率，提升作物產(chǎn)量品質提供了新思路，還為育種家培育“高效、高抗、高產(chǎn)、優(yōu)質”作物新品種提供新基因和新種質資源。此外，鑒于NSP1也是植物與叢枝桿菌共生信號的一個重要組分，BTS-NSP1分子模塊及其作用機制很可能廣泛存在于植物中并參與鐵介導的植物-微生物共生過程。

 

　　華中農業(yè)大學作物遺傳改良全國重點實驗室已畢業(yè)博士研究生任仔銀為本文第一作者，王志娟副教授和李霞教授為本文通訊作者。吉林省農業(yè)科學院農業(yè)生物技術研究所張玲副研究員參與了該項研究工作。該工作得到了國家重點研發(fā)計劃項目、國家自然科學基金重點基金和面上基金、中央高?；究蒲袠I(yè)務費、吉林科技發(fā)展項目等的資助。

 

　　論文鏈接：https://www.nature.com/articles/s41477-024-01896-5